Tak Berkategori

Perbedaan Direct, Indirect, dan Sandwich ELISA

Lanjutan dari artikel: https://blueskypharmacy.wordpress.com/2019/12/16/memahami-eias-feias-dan-elisa-lebih-mudah-disertai-gambar-dan-alasan-penggunaan-bahan/

enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) adalah jenis EIA (Enzim immunoassay) yang secara umum digunakan. Pada ELISA langsung (direct ELISA), antigen diimobilisasi di sumur plat mikrotiter (gambar sumuran pada Gambar 2). Antibody yang spesifik dengan antigen tertentu dan terkonjugasi dengan enzim ditambahkan ke masing-masing sumur. Jika antigen yang dicari tersedia, antibodi akan berikatan. Setelah mencuci untuk menghilangkan antibodi yang tak terikat, substrat tak berwarna (kromogen) ditambahkan. Keberadaan enzim akan mengubah substrat menjadi produk akhir yang berwarna (Gambar 1). Walaupun cara ini lebih cepat karena hanya menggunakan satu antibodi, kerugiannya adalah sinyal dari ELISA langsung lebih rendah (sensitivitas rendah).

Gambar 1. ELISA langsung
Gambar 2. (A) sandwich ELISA, (b) Plat ELISA yang menunjukkan pengenceran antibodi(kiri) dan antigen (bawah). Konsentrasi lebih tinggi menghasilkan warna lebih gelap.

 

Dalam Sandwich ELISA, tujuannya adalah menggunakan antibodi untuk secara tepat menghitung antigen spesifik dalam larutan, seperti antigen dari patogen, protein serum, atau hormon dari darah atau urin sebagai contoh. Tahap pertama dari sandwich ELISA adalah menambahkan antibodi primer ke semua sumur di plat mikrotiter (Gambar 2). Antibodi menempel di plastik melalui interaksi hidrofobik. Setelah waktu inkubasi yang sesuai, antibodi tak terikat dicuci.

Pencuci yang dapat dibandingkan digunakan pada masing-masing urutan tahap untuk memastikan bahwa hanya molekul terikat spesifik yang tetap tinggal di plat. Blocking-protein kemudian ditambahkan (seperti albumin atau kasein protein susu) untuk mengikat situs protein-pengikat nonspesifik di sumur. Beberapa sumur akan menerima sejumlah terukur antigen untuk membangun kurva standar, dan larutan antigen yang tak diketahui ditambahkan ke sumur lain. Antibodi primer menangkap antigen dan, diikuti pencucian, antibodi sekunder ditambahkan, yaitu antibodi poliklonal yang terkonjugasi ke enzim. Setelah pencucian akhir, substrat tak berwarna (kromogen) ditambahkan dan enzim akan mengubahnya menjadi produk akhir yang berwarna. Intensitas warna dari sampel akibay produk akhir diukur dengan spektrofotometer. Jumlah warna yang dihasilkan (diukur sebagai absorban) secara langsung proposional dengan jumlah dari enzim, yang juga secara proporsional dengan jumlah antigen yang terbaca. ELISA sangat sensitif, memungkinkan antigen dikuantifikasi hingga range nanogram ( 10 [SUP] g) per mL.

Padaa indirect ELISA, kita mengkuantifikasi antibodi dengan antigen-spesifik daripada antigennya. Kita dapat menggunakan indirect ELISA untuk mendeteksi antibodi yang melawan banyak jenis patogen seperti Borrelia burgdorferi (Lyme disease) dan HIV. Ada 3 perbedaan penting antara Indirect dan Direct ELISA yang ditunjukkan pada gambar 3. Daripada menggunakan antibodi untuk menangkap antigen, indirect ELISA dimulai dengan menempelkan antigen yang sudah diketahui (cth: peptida dari HIV) ke dasar sumur plat mikrotiter. Setelag menghalau situs tak terikat pada plat, serum pasien ditambahka; jika antibodi ada (primer antibodi), ia akan berikatan dengan antigen. Setelah mencuci protein tak terikat, antibodi sekunder dengan enzim terkonjugasinya dihadapkan melawan antibodi primer (cth: antihuman immunoglobulin). Antibodi sekunder menjadikan kita mampu mengukur berapa banyak antibodi yang antigen-spesifik ada di serum pasien dengan melihat intensitas warna dari produk akhir (menggunakan reaksi kromogen-enzim terkonjugasi).

Selalu ada kemungkinan reaktivitas-silang terhadap antibodi yang dihadapkan melawan beberapa antigen lainnya, yang mengarah kepada hasil positif palsu. Sehingga kita tidak bisa secara definitif mendiagnosa infeksi HIV (atau infeksi lain) berdasarkan uji tunggal Indirect ELISA. Kita harus mengkonfirmasi tes suspek yang positif, yang seringnya baik menggunakan immunoblot yang dapat mengidentifikasi keberadaan peptida spesifik dari patogen, atau tes untuk mengidentifikasi asam nukleat yang ada pada payogen, seperti reverse transcriptase PCR (RT-PCR) atau nucleic acid antigen test.

Gambar 3. a. Indirect ELISA, b. Direct ELISA

Artikel tentang ELISA:

https://blueskypharmacy.wordpress.com/2015/06/08/uji-elisa-prinsip-bahan-yang-dibutuhkan-prosedur-dan-hasil/

https://blueskypharmacy.wordpress.com/2019/12/16/memahami-eias-feias-dan-elisa-lebih-mudah-disertai-gambar-dan-alasan-penggunaan-bahan/

https://blueskypharmacy.wordpress.com/2020/03/25/eias-dan-feias-bag2-immunostaining-elisa/

https://blueskypharmacy.wordpress.com/2020/03/25/eias-dan-feias-bag2-immunostaining-elisa/

https://blueskypharmacy.wordpress.com/2020/03/27/perbedaan-direct-indirect-dan-sandwich-elisa/

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout /  Ubah )

Foto Google

You are commenting using your Google account. Logout /  Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout /  Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout /  Ubah )

Connecting to %s